style="width:4.77334in;height:3.21332in" /> 本文是学习GB-T 33119-2016 葡萄藤猝倒病菌检疫鉴定方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了葡萄藤猝倒病菌的检疫鉴定方法。
本标准适用于葡萄等寄主植物中葡萄藤猝倒病菌的检疫和鉴定。
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件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样
SN/T 2589 植物病原真菌检测规范
学名：Eutypa lata(Pers.)Tul.et C.Tul.
异名：Eutypa armeniacae Hansf.&. M.V.Carter;Eutypa
fraxini(Nitschke)Sacc;Eutypa mil- liaria(Fr.)Sacc.;Eutypa lata
var,aceris Rappaz, Mycol.Helv;Cytosporina lata Hohn;Libertella
blepharis A.L.Sm.
分类地位：采用《真菌词典》第10版分类系统，葡萄藤猝倒病菌(Eutypa
lata)属真菌界(Fungi), 子 囊菌门 (Ascomycota), 盘 菌 亚 门
(Pezizomycotina), 粪 壳 菌 纲 (Sordariomycetes), 炭 角 菌 目
(Xylariales),蕉孢壳科(Diatrypaceae),弯孢壳属(Eutypa
Tul.&.C.Tul.1863)。
传播途径：植物体在贸易和运输中能够传播该病害。植物体主要指树皮(孢子和菌丝),地上部分的
茎、嫩枝、主干、枝条(菌丝),木材(孢子和菌丝)等。
葡萄藤猝倒病菌的其他信息参见附录 A。
葡萄藤猝倒病菌的为害症状、分离培养性状、形态特征和特异性 PCR
检测结果等是该检疫鉴定方
法的主要依据。
生物显微镜、电子天平(感量0.001
g)、离心机(12000g)、普通冰箱、超低温冰箱(一80 ℃)、涡旋振
荡器、恒温光照培养箱、高压灭菌器、生物安全柜、PCR
仪、电泳仪、凝胶分析成像系统、可调微量加样
器、全自动DNA 提取仪。
GB/T 33119—2016
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682
中相关规定。
0.5%次氯酸钠(NaClO)、 葡萄糖、琼脂、硫酸链霉素、盐酸金霉素、氯硝胺。
按照 SN/T
2589,仔细检查寄主植物的茎、枝条、叶片等部位是否出现疑似症状(参见附录
A)。 茎
部主要看有无溃疡症状；枝条是否长势短小，发育受阻，着生的叶子是否萎黄，卷缩变形或破碎；顶部是
否出现枯萎症状。对可疑植物、繁殖材料应取样送实验室做进一步检验，取样方法和步骤参照
SN/T 2122。
将第6章中的可疑植物、繁殖材料等样品进行 PCR 初筛检测，PCR
凝胶电泳检测见附录 B。 对于
阳性结果进行下一步检测。
7.2.1 马铃薯葡萄糖琼脂培养基和选择性培养基的制备
马铃薯(去皮)200 g;葡萄糖20 g;琼脂15 g;蒸馏水补至1000 mL,121℃ 湿热灭菌20
min 备用。 分离培养时加硫酸链霉素(100μg/mL)、 盐酸金霉素(50 μg/mL)、
氯硝胺(5μg/mL) 作为选择性培
养基。
检查寄主的树皮、枝条等组织有无子座、子囊壳，在显微镜下观察病菌的子囊壳，记录其形态特征，
测量子囊和子囊孢子的大小。所获得分离物在马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行单孢分离纯化。
如果发现可疑症状，但不能按7.2.2进行有性型形态检查，应采取下列分离培养的方法做进一步的
鉴定。剥去树皮，纵向劈开树干露出内部溃疡的边缘。在无菌条件下，从溃疡部分的外部边缘切取
1cm² 的薄木片，放在0.5%次氯酸钠溶液中浸泡2 min～5
min,用无菌水重复洗3次，然后用无菌滤纸
吸干，放在选择性培养基上进行培养。24℃培养4 d～7d
后，将疑似菌落转到马铃薯葡萄糖琼脂培养
基上进行分离纯化。
判定结果见附录 B。
葡萄藤猝倒病菌在PDA
培养基首先形成白色棉絮状菌丝，培养基背面奶油色。2周后，培养基上
GB/T 33119—2016
出现灰色色素，培养基背面变成黑色。3周～4周后，在连续的光照培养下，形成小的黑色的分生孢子
器。分生孢子丝状，直或弯曲，数量多，大小(20μm～45μm)×(0.8μm～1.5μm)。
见附录C。
子囊壳直径大约0.5 mm,
在枝干或茎上不规则分布。子囊壳的孔口裂出，具有不明显的沟槽。子
囊从子囊壳顶点释放，子囊顶尖内陷，子囊大小(30μm～60μm)×(5μm～7.5μm),
子囊柄长60μm~
130μm,数量很多，纺锤状，内含有8个子囊孢子。子囊孢子香肠状，金棕色，亚透明，(6.5μm～11μm)×
(1.8μm～2μm)。 在培养基上不能生成子囊壳(见附录C)。
以 PCR
初筛结果、分离物的培养性状、子囊壳的特征等作为鉴定依据，进行综合判定。若
PCR 初
筛结果为阳性，并发现子囊壳，且与8.3鉴定特征吻合，鉴定为葡萄藤猝倒病菌；若PCR
初筛结果为阳
性，未发现子囊壳，但与8.2鉴定特征吻合，鉴定为葡萄藤猝倒病菌。
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出葡萄藤猝倒病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备
复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。
从检测样品中分离并鉴定为葡萄藤猝倒病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于马铃薯葡萄糖琼
脂培养基斜面上，24℃培养72
h,然后4℃冰箱保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员
和审核人员签字。 PCR 凝胶电泳检测需有电泳结果照片。
GB/T 33119—2016
(资料性附录)
葡萄藤猝倒病菌其他信息
A.1 名称
中文名：葡萄藤猝倒病菌。
英文名：Eutypa dieback disease。
A.2 寄主范围
全世界范围来说，葡萄藤猝倒病菌能从至少52个属88种木本双子叶植物中分离到。危害的主要
经济作物包括葡萄属、杏属、李属。在美国加利福尼亚州该病害严重影响葡萄、杏和甜樱桃的产量，是该
地区葡萄上的三大病害之一。在法国和意大利，损失最严重的是葡萄。在澳大利亚和土耳其，损失最严
重的是杏树。自然寄主包括银荆(Acacia dealbata)、栓皮槭(Acer
campestre)、埃及榕(Acer pseudo- platanus)、草莓树(Arbutus
menxiesii)、熊果属(Arctostaphylos)、 欧洲鹅耳(Carpinus betulus)、美 洲
茶属(Ceanothus)、 日本木瓜(Chaenomeles japonica)、柑桔属(Citrus)、 欧
榛(Corylus avellana)、毡 毛 枸子(Cotoneaster
pannosa)、柳叶枸子(Cotoneaster salicifolius)、山楂属(Crataegus)、 楹
椁(Cydonia oblonga)、 柿(Diospyros kaki)、枇 杷(Eriobotrya
japonica)、欧洲水青冈(Fagus sylvatica)、无花果 (Ficus
carica)、欧洲白蜡树(Fraxinus excelsior)、染料木属(Genista)、
洋常春藤(Hedera helix)、胡桃 (Juglans regia)、毒 豆(Laburnum
anagyroides)、马 缨 丹(Lantana camara)、欧洲女贞(Ligustrum vulgare)、
欧洲忍冬(Lonicera xylosteum)、苹果(Malus pumila)、欧洲夹竹桃(Nerium
oleander)、木 樨榄(Olea europaea subsp.europaea)、
阿月浑子乳香树(Pistacia lentiscus)、 阿 月 浑 子(Pistacia
vera)、维多利亚海桐(Pittosporum undulatum)、悬铃木(Platanus
acerifolia)、黑 杨(Populus nigra)、 欧洲山杨(Populus tremula)、杏
(Prunus armeniaca)、欧洲甜樱桃(Prunus avium)、欧洲酸樱桃 (Prunus
cerasus)、欧洲李(Prunus domestica)、扁桃(Prunus dulcis)、桃(Prunus
persica)、李(Prunus salicina)、黑刺李(Prunus spinosa)、西洋梨(Pyrus
communis)、加州白栎(Quercus lobata)、大果栎
(Quercus macrocarpa)、 软 木 楮(Quercus suber)、药 鼠 李(Rhamnus
cathartica)、欧 鼠 李(Rhamnus
frangula)、 酷栗属(Ribes)、 蔷薇属(Rosa)、 黄花柳(Salix
caprea)、西洋接骨木(Sambucus nigra)、加州 胡椒树(Schinus
molle)、肖乳香(Schinus terebinthifolius)、白面子树(Sorbus
aria)、欧洲花楸(Sorbus aucuparia)、 欧洲丁香(Syringa
vulgaris)、柽柳属(Tamarix)、 心叶椴(Tilia cordata)、大叶椴(Tilia
platyphyllos)、 榆属(Ulmus)、 绵毛荚迷(Viburnum
lantana)、欧洲绣球(Viburnum opulus)、美国葡萄
(Vitis labrusca)、沙葡萄(Vitis rupestris)、葡萄(Vitis vinifera)。
A.3 症状描述
该病害在侵染寄主植物2年～3年后才开始表现症状，
一般危害植物的多年生部位。在葡萄上，病
害首先在嫩枝上表现症状，感病的新梢嫩枝发育受阻，长势弱，节间短，其长度小于健康植株嫩枝的一
半，并且长出的叶片明显变小，萎黄色，凹陷，叶片卷缩变形或破碎。嫩枝停止生长，常常在生长季节死
亡。感病较轻的枝条，花序直立，在授粉之前通常落花、干死，不能正常结果。侵染一两年的葡萄树逐渐
变得衰落。葡萄在病菌侵染超过6年后才表现顶枯症状，并且葡萄木质部和韧皮部中的溃疡总是和顶
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枯症状相伴随。主干部位剥皮后可发现黑色的小粒点子囊壳，在木质部的横截面常出现"V"
形的溃疡，
呈灰褐色或紫褐色坏死、变硬，与健康组织界限分明。在溃疡边缘的健康部分通常有变色的条斑或斑
点。随着病害的发展，溃疡逐渐扩大而健康部分逐渐变成细条状。在杏树及其他李属(Prunus)
植物
上，病菌侵染以后，症状发展的比葡萄快速，但通常也需要18个月才表现症状。症状首先表现为枝条分
支的快速萎缩，叶片突然枯萎并且死亡，常呈杯状，但叶片剩余部分仍然留在枝条上，在葡萄上表现皱缩
的叶片在杏树上不会出现。检查死亡的枝条的基部，可以看到围绕着受伤部位有溃疡出现，大多数溃疡
分泌出大量的树胶。
A.4 分布
分布于美国、加拿大、墨西哥、巴西、南非、巴基斯坦、印度、澳大利亚、新西兰、法国、葡萄牙、希腊、意
大利、波兰、瑞士、瑞典、西班牙、乌克兰、捷克、立陶宛、德国、保加利亚、土耳其、利比亚、以色列。
A.5 传播方式
葡萄藤猝倒病菌是腐生和兼性寄生病原菌，很容易侵染寄生，特别是在温暖且雨水比较多的地区。
病原菌以子囊壳越冬，子囊壳萌发产生子囊孢子，子囊孢子通过空气和雨水进行远距离传播。植物体在
贸易和运输中能够传播该病害，植物体主要指树皮(孢子和菌丝);地上部分的茎、嫩枝、主干、枝条(菌
丝);木材(孢子和菌丝)等。而果实、随植物所带的介质、花、花序、(松树、冷杉树等的)球果、花萼、叶片、
幼苗、组培植物、根、种子等目前不确定能否传播该病害。
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(规范性附录)
PCR 凝胶电泳检测
B.1 寄主植物 DNA 的提取
将有疑似症状的样品或随机抽取的样品采用植物 DNA 提取试剂盒对样品进行DNA
提取。
B.2 引物序列
正向引物 ED1:5'-TGGTGGACGGGTAGGGTTAG-3';
反向引物 ED2:5'-GGCCTTACCGAAATAGACCAA-3';
扩增片段大小为643 bp。
B.3 PCR 反应体系及参数
B.3.1 PCR 反应体系
PCR 反应体系见表 B.1。
表 B.1 PCR 反应体系
|
|
|---|---|
|
|
|
2.5 mmol/L |
|
0.2 mmol/L |
|
0.2 μmol/L |
|
0.2 μmol/L |
|
2.5 U |
|
0.5 ng/μL |
|
50 μL |
B.3.2 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置
B.3.2.1 阴性对照：以待测健康的植株组织洗涤液中提取的 DNA 为模板。
B.3.2.2 阳性对照：采用葡萄藤猝倒病菌或含有待测基因序列的质粒。
B.3.2.3 空白对照：设两个， 一是提取DNA 时设置的提取空白对照(以H₂O
代替样品),二是 PCR 反
应的空白对照(以水代替 DNA 模板)。
B.3.3 PCR 反应参数
94℃/2 min;93℃/30 s,65℃/30 s,72℃/1min,37个循环；72℃/10 min。
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B.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测
制备1.2%的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和 PCR 扩增产物，用DNA
Marker 作为分
子量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性
DNA 条带，并拍摄记录。
B.4 结果判断
阴性对照和空白对照在643 bp 处未出现扩增条带，待测样品与阳性对照在643
bp 处出现扩增条
带，判定结果为阳性。
阴性对照和空白对照在643 bp 处未出现扩增条带，阳性对照在643 bp
处出现扩增条带，且样品无
特异性扩增，判定结果为阴性。
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(规范性附录)
葡萄藤猝倒病菌症状及形态特征图
葡萄藤猝倒病菌症状及形态特征图见图 C.1～ 图 C.6。
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注1: 图左为健康，图右为发病。
注 2 : 引 自 Gary P.Munkvold。
图 C.1 葡萄藤猝倒病菌发病症状
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注：引自 Gary P.Munkvold。
图 C.2 葡萄藤猝倒病菌在木质部横截面症状图
style="width:3.14006in;height:4.5199in" />
注：引自 Gary P.Munkvold。
图 C.3 葡萄藤猝倒病菌在葡萄上的子囊壳
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style="width:3.10655in;height:4.55994in" />
注：引自Gary P.Munkvold。
图 C.4 感病杏树上分泌的树胶
style="width:2.26009in;height:4.99334in" />
说明：
a—— 子囊；
b— 子囊孢子。
注：引自Gary P.Munkvold。
图 C.5 葡萄藤猝倒病菌的子囊和子囊孢子
style="width:4.15344in;height:2.80016in" />
注：引自Gary P.Munkvold。
图 C.6 葡萄藤猝倒病菌的子囊孢子
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